二成分指纹指标通片图谱液相研究定量高效便可及多分析

2.4.2共有峰的通片图谱确定

根据10批便可通片的指纹图谱检测结果，共标出16个共有峰，高效样品峰经与对照品比较分析，液相研究指认出5个共有成分，指纹指标其中2号峰为松果菊苷，及多4号峰为柚皮苷，成分5号峰为新橙皮苷，定量9号峰为芦荟苷，分析15号峰为芦荟大黄素，通片图谱见图2。高效9号峰分离度较好，液相研究峰面积也比较稳定，指纹指标故选择此峰作为参照峰。及多

2.4.3指纹图谱相似度评价

将10批样品指纹图谱与对照指纹图谱分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版）软件进行相似度评价。结果10批便可通片相似度在0.971～0.999之间，定量表明相似度良好，结果见表3。

2.4.4共有峰的来源确认

分别取便可通组方中的各单味药材适量，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备药材样品溶液。分别精密吸取供试品溶液和各单味药材样品溶液各10μL进样，注入高效液相色谱仪，记录100min色谱图。对保留时间保持一致的色谱峰进行分析比较，根据紫外光谱信息，对全方与药材指纹图谱的相关峰进行指认，确认共有峰的药材归属，见图3。

确认了便可通片HPLC指纹图谱中16个特征峰的来源，其中2、3号峰来自肉苁蓉，3号峰来自生地黄，3号峰来自玄参，4、5、7号峰来自枳实，1、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16号峰来自芦荟，16号峰来自当归，16号峰来自决明子。火麻仁、桃仁成分多为末端吸收，在该色谱条件下基本无响应，故在样品中未进行共有峰标记。

2.5指标成分的含量测定

2.5.1线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下制备的对照品溶液适量，分别加入流动相（或甲醇）稀释成系列质量浓度的对照品溶液进行测定，进样10μL,测定其峰面积，以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程。结果见表4。

2.5.2加样回收率试验

精密称量已知芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷含量的样品（S1)0.5g，共6份；分别精密加入芦荟苷对照品8.1mg，柚皮苷对照品7.9mg，新橙皮苷对照品8.6mg，松果菊苷对照品溶液（0.5196mg·mL^-1)3.5mL，即1.8mg；置50mL棕色量瓶中，按照“2.2.2”项下操作，即得。按“2.1”项下色谱条件进行分析，结果芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷的平均加样回收率分别为101.62%、99.52%、102.05%和98.35%，RSD分别为2.01%、1.95%、2.21%和2.84%，表明本方法对各成分的加样回收率符合要求。

2.5.3样品含量测定

取10批便可通片样品适量，精密称定，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析。结果见表5。

3讨论

本研究考察了便可通片不同提取方式（超声提取、加热回流提取），不同提取溶剂（乙醇、水、甲醇、50%甲醇）的提取效果，结果表明以甲醇超声提取效果最佳。

本研究采用DAD检测器全波长扫描的方式，参考处方各单味药材有效成分的检测波长，提取出200、220、235、260、280、300nm等波长下的图谱进行比较，结果发现在300nm下，样品色谱图呈现的色谱峰数目多，且响应值较高。同时考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%冰醋酸水、甲醇-0.2%冰醋酸水4种流动相系统，发现采用甲醇-0.1%冰醋酸水流动相系统，参照峰（芦荟苷）峰型较好，分离度、对称因子和理论塔板数均较好。

本研究对便可通片全方与药材指纹图谱的相关峰进行指认，确认了5个峰的物质成分，主要来自肉苁蓉、枳实、芦荟。肉苁蓉中发挥改善肠胃功能的药效物质基础为苯乙醇苷类化合物，其中松果菊苷能缓解便溏和便血，促进受损肠道肌层表皮细胞的增殖和减少炎性浸润。枳实中柚皮苷、新橙皮苷等黄酮类成分，可改善功能性消化不良大鼠的胃排空和小肠推进；芦荟含有芦荟苷等蒽醌成分，具有泻下通便的功效，故本研究选择松果菊苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷4种成分进行定量测定。含量测定结果表明，便可通片10批样品中松果菊苷、芦荟苷含量变化较大。本研究发现，芦荟苷对照品（甲醇溶解）放置较长时间后会降解成2个峰，分别对应样品中8、9号峰。亦有文献报道芦荟苷大部分是芦荟苷A和芦荟苷B两个光学异构体的混合体，其对照品峰面积的改变直接影响样品中芦荟苷含量的计算。故本实验对芦荟苷对照品的配置进行研究，分别用甲醇、流动相溶解，考察0、2、4、6h芦荟苷降解率。结果表明，芦荟苷在流动相混合溶液中较甲醇溶液中更为稳定。因此，选择芦荟苷作为质控指标尤为重要。

本研究建立了10批便可通片的指纹图谱，采用指纹图谱软件共标定出16个共有峰，相似度均大于0.95，说明所建立的指纹图谱具有较好的可控性，可为便可通片的质量评价提供依据。方法学试验表明该色谱方法可同时定量分析芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷的含量。采用上述建立的HPLC指纹图谱方法，可同时对便可通片药材、饮片与成品进行指纹图谱检测和有效成分含量测定，实现终端质控向生产过程质量控制过渡，以提升产品质量，稳定产品品质，为便可通片的上市生产奠定了基础。

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